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产品描述

萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）是一种分子量约为61 kDa的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，能够催化萤光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在氧化的过程中会发出波长为560 nm左右的生物萤光。海肾萤光素酶（Renilla luciferase）是一种分子量约为36 kDa的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素（coelenterazine）氧化成coelenteramide，在氧化的过程中会发出波长为480nm左右的生物荧光。两种生物荧光都可通过化学发光仪进行测定。检测原理如图所示：

图1：萤火虫和海肾萤光素酶检测原理图

通常将目的基因的5´UTR或启动子克隆至Firefly Luciferase的上游，或3´UTR克隆至Firefly Luciferase的下游，通过检测萤火虫萤光素酶的量来检测启动子或调控元件的转录调控作用。Renilla Luciferase作为内参，来消除细胞数量、转染效率等的差异。Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit首先以萤光素为底物来检测萤火虫萤光素酶报告基因的活性，之后在淬灭该萤光反应的同时，以腔肠素为底物检测海肾萤光素酶报告基因的活性。该试剂盒具有灵敏度高的特点。

产品组分

运输和保存方式

干冰运输。 -20℃保存，有效期1年。

萤火虫萤光素酶反应工作液和海肾萤光素酶反应工作液现配现用，且不能反复冻融，建议分装-20℃或-80℃保存。

实验步骤

I.前处理

1.细胞

1）构建相应的载体。

2）转染步骤请参照相关的说明书。

3）将细胞裂解液充分混匀，按如下方式加入细胞裂解液，充分裂解细胞。

a: 对于贴壁细胞，吸尽细胞培养液，按照下表比例加入细胞裂解液，轻轻旋转培养皿或者培养板使裂解液完全覆盖细胞；

b: 对于悬浮细胞，离心弃去上清，按照下表比例加入裂解液。

4）冰上孵育5 min，充分裂解细胞。

【注】：裂解产物可室温保存6 h；4℃保存16 h；-80℃可长期存放。（裂解产物不能多次反复冻融），本试剂盒裂解液数量按照24孔板添加量进行配置，如需要更多可单独购买（CAT#11406）。

5）（选作）10000-16000 rpm离心1 min，取上清。

2.叶片组织（以烟草叶片为例，仅供参考）

1）构建相应的载体。

2）挑取转化有重组质粒的农杆菌单菌落，接种到2 mL LB液体培养基（添加相应抗生素）中，28℃ 220 rpm培养过夜。

3）农杆菌培养至OD₆₀₀为1.0，1700× g离心5 min收集菌体后，用1/2MS液体培养基清洗菌体2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基将农杆菌的OD₆₀₀调至1.0。

4）将待检测的农杆菌菌液进行混合，使每种菌液的OD₆₀₀为0.5。

5）选取生长期为1个月左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用1 mL注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射。为保证实验结果的一致性，需要将对照载体和待检测目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上, 以保证相同的生长背景。

6）正常温室生长条件下，24-48 h即可取样观察。

7）取3-4片直径为6-8 mm的叶盘，放入2 mL的EP管（提前放入3-4个小钢珠）中，液氮中冷冻，使用破碎仪进行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎完全后在EP管中加入100 μL裂解液。

8）冰上孵育5 min左右，充分裂解叶片。

9）10000-16000 rpm离心1 min，取上清。

3.原生质体（仅供参考）

1）构建相应的载体。

2）制备原生质体（参考文献：Yoo SD, Cho YH, Sheen J (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc 2, 1565–1572）。

3）在2 mL EP管中加入相应的载体（加入量需要摸索），加入100 μL原生质体悬浮液。轻摇混匀后，加入110 μLTUNEology 波长可调检测卡盒-->